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 SDS-PAGE란 Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis의 줄임말로, 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기영동법 이라고 합니다.

 Agar보다 acrylamide가 더 촘촘하기 때문에 더 크기가 작은 분자의 물질들을 구분하는데 사용하고, 주로 protein의 발현이나 정제를 확인하는데 사용합니다. (agarose gel의 경우는 DNA)

 SDS를 사용해 모든 protein을 - charge를 띄도록 해 주고, gel의 윗부분에는 - charge, 아랫부분에는 + charge를 띄게 전류를 흘려보내주어 정전기적 인력, 척력의 힘으로 protein을 loading해 size별로 구분하는 방법입니다. 크기가 큰 protein의 경우는 촘촘한 polyacrylamide gel을 빠르게 내려오지 못해 상대적으로 위에 나오고, 크기가 작은 protein은 아래쪽에 나오게 됩니다.


이론


1. SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

 Protein의 경우 polypeptide이기 때문에 amino acid의 조성에 따라 pI값이 다 다르고, 이로 인해 + charge와 - charge를 띄는 protein이 있게 되는데, SDS는 protein을 unfolding시켜주고 - charge를 띄게 해주는 성질을 가집니다.

 계면활성제 성분으로 몸에 안좋을 수 있기 때문에 조심해아 합니다.




2. Polyacrylamide gel

 Polyacrylamide gel은 stacking gel과 separating gel 2개의 부분으로 나뉘는데 stacking gel은 sample이 들어갈 수 있는 well이 있으며, 모든 size의 protein이 동일한 선상에서 출발 할 수 있도록 압축해 주는 역할을 합니다. 이에 반면에 separating gel은 protein을 size별로 나눠주는 역할을 합니다.

 Acrylamide는 신경독성을 가지고 있어 gel을 만들거나 sample을 loading할 때 조심해야 합니다.





3. Sample

 SDS-PAGE를 내리는 sample은 protein입니다. protein은 polypeptide의 3차 혹은 4차구조를 띄고 있는데, 이들은 amino acid간의 peptide bond 말고도 amino acid 잔기 끼리의 hydrogen bond나 cystein 사이에서 나타나는 disulfide bond를 이루고 있어 이러한 결합을 잘라주어야 합니다. hydrogen bond같은 경우는 비공유결합으로 SDS만으로 잘릴 수 있지만 disulfide bond와 같이 강한 공유결합의 경우는 끊기 힘들기 때문에 DTT(DiThioThreitol)이나 2-mercaptoethanol등을 넣고 끓여 protein이 완전히 unfoling될 수 있도록 해줍니다.


4. Marker protein

 Sample만 가지고 SDS-PAGE를 loading하게 되면 나중에 우리가 원하는 size의 protein이 있는지, 있다면 어디에 있는지 알 수 없습니다. 이를 방지하기 위해 marker protein이라는 것을 사용하는데, 이는 이미 size를 알고있는 protein들을 적절히 섞어두어 나중에 staining을 했을경우, protein size의 지표가 될 수 있고, 이를 통해 우리가 원하는 protein이 어디에 있는지 찾을 수 있습니다.


 SDS-PAGE후에 염색한 polyacrylamide gel의 사진입니다.

맨 처음에 있는 sample이 marker protein이고 그 뒤로 protein입니다.




실험과정


1. Cell을 sonicator나 microfluidizer등을 이용해 파쇄합니다.


2. EP tube에 파쇄된 cell과 sample buffer (SDS, glycerol, Tris-HCl, bromophenol blue, dtt)를 섞어줍니다.

(여기서 cell에 불순물이 있거나, soluble protein과 insoluble protein을 구분하려면 centrifugation을 하여 나누면 됩니다.)


3. 끓는 물에 5~10min동안 boiling합니다.


4. Electrophoresis tank에 gel과 buffer를 넣어준 뒤, sample을 well에 넣어주고 loading합니다.


5. Coomassie brilliant blue염색약으로 10~30min staining한 뒤, destaining buffer를 이용해 염색약을 washing해 줍니다.




SDS-PAGE의 경우는 복잡하거나 신경을 써서 해야할 부분이 많이 없습니다. 실험에 쓰이는 시료의 성분들이 무슨 일을 하는지, 어떤 원리로 protein이 size별로 나뉘는지 알고 편하게 실험을 하면 될거 같네요^^






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Posted by 안양_박건영

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