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  1. 2017.02.10 [생화학] 단백질의 분리와 정제





 이번에는 단백질의 분리와 정제에 대해 알아보겠습니다.


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 대부분의 단백질 시료들은 순도가 높아야 합니다. 하지만 대부분의 재조합 단백질들은 세포안에서 만들어지고, 이 세포들은 무수히 많은 단백질을 함유하고 있습니다.


 세포속의 무수히 많은 단백질들 가운데 우리가 원하는 단백질을 분리하고 정제하기 위해서는 다른 단백질들과 구별되는 우리가 원하는 단백질만의 크기, 전하, 특이성 등을 이용할 수 있습니다.


 하지만 위에서 말했든 단백질은 대부분 조직이나 세포속에 들어있기 때문에, 이를 파괴하여 조추출물(crude extract)라는 것을 얻어 단백질을 세포 밖으로 꺼낸 뒤 분리 및 정제를 하게 됩니다.


 분별, 분획법 (fractionation)은 혼합물을 물리적 화학적 성질의 차이(pH, 온도, 염 등)를 이용하여 분리 할 수 있습니다.


단백질의 침전 출처1     

 단백질은 염의 농도가 높을때 용해도가 낮아지는데, 이러한 현상을 염석(salitng out)이라고 합니다. 단백질이 침전되는 염의 농도는 단백질마다 다르기 때문에 이런 방법을 통해 염의 양을 증가시켜 특정 단백질만을 침전시킬 수 있습니다.


 또한 투석(dialysis)방법은 투석막과 혼합물과 solvent의 농도의 차이를 통해 투석막에 뚫려있는 분자의 크기에 따라 우리가 원하는 size이하의 단백질을 빠져나가게 할 수 있고, 위에서 사용한 salt등 저분자물질들을 분리하는데 사용합니다.


 또 실험에서 많이 사용되는 분리 정제방법에 chromatography가 있는데, 이는 단백질의 크기, 전하, 친화력 등을 사용하는 방법입니다.

 이 방법은 고정상(stationary phase)와 이동상(mobile phase)를 사용하는데, 고정상은 단백질과 반응하는 물리, 화학적 특성을 가진 물질(resin)로, 이를 원통형 column에 채우고, 이동상을 흘려보내는 방식으로 실험합니다.


이온 교환 크로마토그래피 출처2   

 

 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)는 혼합액의 pH에서 단백질이 가지는 전하의 차이에 의해 분리하는 방법입니다. resin이 전하를 띄고 있어 이에 따라 양전하의 resin에서는 음전하의 protein이 붙는 원리를 사용한 분리방법입니다.


 Resin이 가지는 이온의 전하에 따라 양이온 교환체(cation exchanger), 음이온 교환체(anion exchanger)라고 하고, 음전하를 띄는 resin을 사용하는 chromatography를 양이온 교환 크로마토 그래피(cation chromatography), 양전하 resin을 사용하는 것을 음이온 교환 크로마토 그래피(anion chromatography)라고 합니다.



               친화 크로마토그래피 출처3


 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)는 resin과 단백질 사이의 결합적 특이성에 기반을 두고 있습니다. resin에는 ligand가 붙어있어 혼합물이 흘러갈 때 resin의 ligand와 결합하는 protein은 남게되고, 다른 것들은 흘러나가는 친화력의 차이에 의한 분리방법입니다.

 Column안에 남게되는 단백질들은 고농도의 염 또는 ligand를 흘러보내주어 용출합니다. 여기에는 maltose와 maltose binding protein, Ni2+이온과 imidazole, 항원항체 등이 사용됩니다.



크기-배제 크로마토그래피 출처4     


 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)은 gel filtration이라고도 하는데, 단백질의 크기에 따라 분리하는 방법입니다. resin에 작은 구멍이 뚫려있어 크기가 작은 단백질은 구멍을 통과며나와 오래걸리고 크기가 큰 단백질은 구멍에 들어가지않고 빠져나와 먼저 나오게 되는 방식입니다.



 이 외에도 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)가 있는데, 이는 매우 높은 품질의 단백질을 분석하는데 사용되기 때문에 나중에 따로 다루겠습니다.



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Posted by 안양_박건영